qPCR實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常忽略的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)？你有被cue了嗎？（qpcr實(shí)驗(yàn)步驟詳細(xì)）
在 實(shí)時(shí)熒光定量PCR ( qPCR )實(shí)驗(yàn)中，每一個(gè)細(xì)節(jié)都可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。然而，在忙碌的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們往往會(huì)忽略一些看似微不足道但至關(guān)重要的步驟。今天，就讓我們一起回顧那些常被cue到但又常被忽略的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)吧！
圖片來(lái)源：GenStar官網(wǎng)
(1) 避免污染:?使用新的、無(wú)污染的槍頭和離心管，避免交叉污染。
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(2) Mg2?濃度: Mg2?濃度影響DNA聚合酶活性，需根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)整。現(xiàn)在商品化SYBR qPCR mix中的 Mg2?濃度都 是調(diào)整好的，除非有特殊需求才需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)整Mg2?濃度。
(1) 設(shè)置陰性對(duì)照: 以PCR水替代模板設(shè)置陰性對(duì)照，排除模板污染造成的假陽(yáng)性。另外，可以通過(guò)這篇文章了解一些qPCR實(shí)驗(yàn)的名詞解釋《 qPCR實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，目標(biāo)樣本，NTC和NRT的概念 》。
(1) 引物設(shè)計(jì):?引物設(shè)計(jì)應(yīng)避免互補(bǔ)序列，3’端避免連續(xù)三個(gè)以上的G或C。可以通過(guò)這篇文章了解引物設(shè)計(jì)《 干貨 | NCBI/Oligo 7/primer 5 三種方法進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)教程 》。
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